Ciblage des ARNt pour une suppression traductionnelle spécifique de mutations non-sens dans le gène CFTR

Porteur du projet : Olivier NAMY

Contexte :
Le projet poursuit trois objectifs. Le premier est de comprendre comment le contexte nucléotidique entourant le PTC détermine l'efficacité de la translecture et la nature des acides aminés incorporés au codon stop. Le deuxième est d'identifier et d'optimiser des ARNt suppresseurs capables de décoder efficacement des PTC pathogènes dans CFTR, en ciblant des positions non-anticodon du corps de l'ARNt grâce à une stratégie combinant mutagenèse ciblée et prédictions structurales. Le troisième objectif est de valider fonctionnellement les approches les plus prometteuses dans des modèles cellulaires de mucoviscidose, en évaluant la restauration de l'expression et de l'activité de transport du canal CFTR.

Objectifs :
Le projet poursuit trois objectifs. Le premier est de comprendre comment le contexte nucléotidique entourant le PTC détermine l'efficacité de la translecture et la nature des acides aminés incorporés au codon stop. Le deuxième est d'identifier et d'optimiser des ARNt suppresseurs capables de décoder efficacement des PTC pathogènes dans CFTR, en ciblant des positions non-anticodon du corps de l'ARNt grâce à une stratégie combinant mutagenèse ciblée et prédictions structurales. Le troisième objectif est de valider fonctionnellement les approches les plus prometteuses dans des modèles cellulaires de mucoviscidose, en évaluant la restauration de l'expression et de l'activité de transport du canal CFTR.

Perspectives :
La troisième et dernière année de thèse sera consacrée à la finalisation du projet selon deux grandes orientations : la consolidation des résultats mécanistiques obtenus sur les déterminants de la translecture, et la validation fonctionnelle des approches les plus prometteuses dans des modèles cellulaires pertinents pour la mucoviscidose.

Finalisation de l'étude du contexte du PTC. Les résultats déjà obtenus ont mis en évidence que les nucléotides situés immédiatement en 3' du PTC influencent à la fois l'efficacité du readthrough et la nature des acides aminés incorporés. L'objectif sera de consolider ces observations par une quantification absolue des peptides de translecture, en s'appuyant sur l'utilisation de peptides AQUA lourds en spectrométrie de masse en tandem. Cette approche permettra d'obtenir des mesures quantitatives robustes et de renforcer l'interprétation moléculaire des résultats. Ce travail donnera lieu à la rédaction d'un manuscrit dédié, qui constitue une contribution originale à la compréhension des mécanismes de sélection des ARNt au niveau des codons stop prématurés.

Finalisation du crible des isodécoders de tRNA Cys. Les résultats acquis suggèrent une forte dépendance au contexte mutationnel dans la réponse aux ARNt suppresseurs. L'objectif de cette dernière année est de compléter de manière systématique l'analyse des différents isodécoders du tRNA Cys, afin d'identifier les variants les plus efficaces et de préciser dans quels contextes mutationnels ils peuvent être utilisés.

Validation fonctionnelle en collaboration avec l'équipe d'Isabelle Sermet-Gaudelus. L'essentiel de l'année sera consacré à cette étape centrale, qui doit permettre de passer d'une démonstration fondée sur des essais de translecture in cellulo à une évaluation directe de la restauration fonctionnelle de CFTR. Deux axes principaux seront développés.

Sur la mutation Y122X, nous évaluerons les ARNt suppresseurs optimisés, afin de déterminer s'ils permettent d'obtenir une restauration fonctionnelle mesurable de la protéine CFTR. Sur la mutation G542X, nous analyserons le potentiel des ARNt Gly suppresseurs optimisés, en particulier ceux identifiés comme les plus actifs au cours du projet.

Les tests fonctionnels seront réalisés de manière progressive. Dans un premier temps, nous vérifierons par western blot le profil de maturation de la protéine CFTR produite après suppression traductionnelle, afin de nous assurer de la compatibilité de la protéine restaurée avec une fonctionnalité correcte. Dans un second temps, l'activité de CFTR sera évaluée par un test de transport d'iodure reposant sur un rapporteur fluorescent YFP sensible à la concentration intracellulaire en iodure. Enfin, des mesures de courants de court-circuit seront réalisées dans une lignée 16HBE G542X homozygote obtenue par l'équipe d'Isabelle Sermet-Gaudelus auprès de la Cystic Fibrosis Foundation, fournissant une lecture fonctionnelle de référence pour l'activité du canal CFTR dans un modèle physiologiquement pertinent.

Valorisation. En parallèle de ces travaux expérimentaux, l'année sera consacrée à la rédaction des manuscrits correspondants aux deux axes principaux du projet (étude du contexte du PTC d'une part, identification et optimisation des ARNt suppresseurs d'autre part) afin d'aboutir à une conclusion complète et solide de la thèse.

Résultats obtenus :
Les deux premières années ont apporté plusieurs avancées majeures. Il a été démontré que les trois nucléotides situés en 3' du PTC constituent le déterminant principal de l'efficacité de la translecture, mais influencent également la nature des acides aminés incorporés. C’est un résultat inattendu révélant un niveau de contrôle fin de la sélectivité des ARNt. Par ailleurs, une stratégie combinant mutagenèse du tRNA Gly et prédictions structurales par AlphaFold3 a permis d'identifier un variant dont l'activité de suppression est augmentée d'un facteur ~1000 par rapport au tRNA sauvage. Ces résultats établissent une base solide pour la validation fonctionnelle prévue en troisième année.