Analyse protéomique et métabolomique des cytosols de neutrophiles chez les patients atteints de mucoviscidose avant et après traitement par les nouveaux modulateurs de CFTR associant elexacaftor, tezacaftor et ivacaftor

Porteur du projet : Véronique WITKO-SARSAT

Contexte :
La mise à disposition des modulateurs de CFTR a permis une avancée thérapeutique majeure pour les patients atteints de mucoviscidose éligibles. Ces modulateurs de CFTR améliorent la fonction respiratoire et diminuent les exacerbations respiratoires chez les patients mucoviscidosiques.

Les neutrophiles sont des cellules de l'immunité innée qui jouent un rôle majeur dans les mécanismes inflammatoires pulmonaires de la mucoviscidose. En libérant des oxydants et des protéases suite
à leur activation par des agents bactériens, ils contribueraient à l’apparition de modification structurales bronchopulmonaires, en particulier les dilatations des bronches. 

Nous voulons étudier de façon approfondie l'effet des traitements par les modulateurs de CFTR sur les fonctions des neutrophiles chez les patients et identifier si le traitement par les modulateurs de CFTR a un effet bénéfique sur les neutrophiles et, le cas échéant, identifier les mécanismes qui sont en jeu.

Objectifs :
L’étude menée en collaboration avec le service de pneumologie de l’hôpital Cochin sous la direction du Pr Pierre-Régis Burgel a permis de prélever des patients atteints de mucoviscidose et d’isoler leurs neutrophiles avant l’initiation du traitement par Kaftrio et environ 2 mois plus tard sous Kaftrio. 

Si un certain nombre d’analyses ont été effectuées sur les neutrophiles fraichement isolés, nous souhaitons maintenant analyser de façon précise les modifications des neutrophiles chez ces patients après la prise du Kaftrio en identifiant les protéines et les petites molécules appelées métabolites qui constituent les neutrophiles et sont des marqueurs de leur fonctionnement. 

Nous allons réaliser un catalogue appelé "analyse protéomique" et "analyse métabolomique". Nous comparerons ce catalogue AVANT et APRES traitement chez chacun des patients traités. 

En identifiant les familles de protéines ou de métabolites nous allons identifier les voies métaboliques et les fonctions qui sont modifiées ou corrigées par le traitement et celles qui ne le sont pas. Ceci nous permettra dans le futur de cibler ces voies afin d’améliorer la prise en charge des patients.

Perspectives :
Après traitement par Kaftrio, un médicament destiné à corriger le défaut génétique à l’origine de la mucoviscidose, nous avons observé une augmentation d’une protéine appelée lactoferrine, connue pour ses propriétés antimicrobiennes. Cette protéine est contenue dans des structures internes des neutrophiles appelées granules secondaires. Cette observation suggère que le traitement améliore les capacités de défense de ces cellules contre les infections.

Par ailleurs, les chercheurs poursuivent des analyses sur une autre protéine clé dans cette maladie : PCNA. Cette protéine joue plusieurs rôles dans la cellule, notamment dans sa survie, et elle est retrouvée en excès dans les neutrophiles des patients atteints de mucoviscidose. Pour mieux comprendre son implication, des tests sont menés pour isoler cette protéine et les partenaires qu’elle attire dans la cellule, en utilisant une technique appelée immunoprécipitation. Les protocoles utilisés ont été modifiés pour éviter que certaines protéines ne s’y retrouvent par erreur à cause de la présence d’ADN et d'ARN. Les échantillons obtenus seront prochainement analysés par spectrométrie de masse pour identifier les protéines associées à PCNA.

En parallèle, des cultures de cellules appelées HL-60, un modèle utilisé pour étudier les neutrophiles en laboratoire, ont été lancées. Ces cellules serviront à explorer plus en détail plusieurs aspects du fonctionnement des neutrophiles, notamment la dégranulation, le métabolisme des lipides, et la réponse au stress cellulaire. Ces études devraient permettre de mieux comprendre les différences entre les neutrophiles de patients traités et non traités, ainsi que ceux portant ou non les mutations génétiques spécifiques à la mucoviscidose.

Pour les années suivantes du projet, plusieurs axes de recherche sont planifiés. Les travaux sur la dégranulation se poursuivront par l’analyse de nouvelles protéines potentiellement impliquées dans ce processus, ainsi que par des tests enzymatiques pour évaluer l’activité de certaines enzymes spécifiques aux neutrophiles. Une collaboration est en cours avec des spécialistes de l’hôpital Bichât pour tester l’effet de ces enzymes et protéines sur deux bactéries fréquemment retrouvées chez les patients atteints de mucoviscidose : Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.

Concernant les aspects liés au métabolisme, nous analyserons les protéines présentes dans différentes fractions des neutrophiles, en ciblant celles impliquées dans le métabolisme des lipides. Il sera également question d’analyser la réponse des cellules à un stress interne, qui pourrait être perturbé par la mutation de la protéine CFTR. Les cellules HL-60 seront utilisées pour tester ces hypothèses, notamment à l’aide de marquages permettant de visualiser si les cellules stockent davantage de graisses, ce qui pourrait être une conséquence de la maladie.

Des collaborations scientifiques sont aussi prévues avec des experts du métabolisme à l’Institut Cochin. Dans ce cadre, nous mènerons des expériences consistant à nourrir les cellules avec des nutriments marqués (glucose, acides gras) pour suivre leur transformation à l’intérieur des cellules. Ces expériences permettront d’évaluer le fonctionnement des voies métaboliques, notamment celles impliquées dans la production d’énergie.

Les cellules HL-60 serviront également à tester l’effet de différents composés, dont le T2AA, un inhibiteur de la protéine PCNA, ou encore des substances capables d’activer certaines voies biologiques impliquées dans la réponse au stress ou dans le métabolisme lipidique. L’objectif est d’identifier les mécanismes précis par lesquels la mutation de CFTR affecte le fonctionnement cellulaire, et comment le traitement par Kaftrio peut potentiellement rétablir un équilibre.

Ces travaux devraient contribuer à mieux comprendre le fonctionnement des neutrophiles dans la mucoviscidose, et à évaluer de manière plus fine les effets du traitement Kaftrio sur ces cellules, avec l’objectif à terme d’identifier de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge de la maladie.

Résultats obtenus :
L’analyse des fonctions des neutrophiles a été réalisée par diverses techniques : mesure de leur capacité à mourir par apoptose, essentielle au bon fonctionnement de la réponse immunitaire, ainsi que leur capacité à produire des espèces réactives de l’oxygène par un mécanisme appelé burst oxydatif, et le comptage de leur nombre dans le sang.

Les résultats obtenus indiquent que leur capacité à mourir est diminuée dans la mucoviscidose non traitée et leur nombre est trop élevé. Ces anomalies sont partiellement corrigées par la prise du traitement. 

Les métabolites des neutrophiles ont été analysés pour des patients avant et après prise du traitement et pour des donneurs sains de l’EFS. Les premières analyses des résultats obtenus permettent d’identifier des métabolites qui sont moins présents dans les neutrophiles de patients. 

La majorité de ces métabolites sont importants pour le métabolisme des lipides, ce qui suggère que l'utilisation des lipides par les neutrophiles est perturbée dans la mucoviscidose. Après traitement, on observe une correction de ces métabolites, ce qui suggèrerait une meilleure gestion de ces molécules par les neutrophiles.