L’acquisition du fer extracellulaire chez le champignon multirésistant Scedosporium apiospermum : une cible thérapeutique potentielle

Porteur du projet : Anaïs HÉRIVAUX

Contexte :
Les poumons des patients atteints de mucoviscidose sont fréquemment colonisés par des microorganismes qui peuvent provoquer des infections respiratoires. Les bactéries et spores fongiques inhalées sont piégées dans le mucus où elles trouvent un environnement favorable à leur développement. Scedosporium apiospermum est un champignon microscopique qui colonise fréquemment les voies respiratoires. En raison de sa capacité à disséminer en l'absence de défenses immunitaires et de sa faible sensibilité aux antifongiques actuels, la colonisation des voies respiratoires par ce microbe compromet souvent les chances de succès d'une transplantation pulmonaire. Il est donc nécessaire d'améliorer le dépistage de ce champignon, mais aussi de découvrir de nouveaux traitements plus efficaces, ce qui nécessite une meilleure connaissance des mécanismes à l’origine du pouvoir pathogène de ce microbe.

Objectifs :
Notre projet vise à caractériser les gènes de Scedosporium apiospermum codant les transporteurs membranaires permettant aux cellules fongiques d’assimiler le fer. Plus précisément, nous tenterons de démontrer en utilisant diverses technologies que ces transporteurs sont indispensables au développement du champignon et qu’ils représentent des déterminants majeurs de la virulence, permettant au champignon de s’établir dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose. En supprimant, grâce à nos outils génétiques, la capacité de S. apiospermum à assimiler le fer extracellulaire, nous démontrerons que l’absence de ces transporteurs du fer rend le champignon incapable de se multiplier dans un milieu pauvre en fer, et donc inoffensif. L’ensemble de ces expériences permettra donc de montrer que les transporteurs du fer sont indispensables à S. apiospermum pour coloniser les voies respiratoires et engendrer une infection.

Perspectives :
Si seules des études cliniques menées sur un grand nombre de patients apportera la preuve scientifique de la bonne tolérance et de l’efficacité de la phagothérapie dans le contexte de la mucoviscidose, des études fondamentales, telles que celles préconisées dans le cadre de ce projet, restent absolument nécessaires pour optimiser l’efficacité d’action des phages et accroître notre éventail de phages thérapeutiques pour que davantage de patients puissent rapidement avoir recours à la phagothérapie en cas de besoin. Nos résultats sont particulièrement intéressants puisqu’ils démontrent, pour la première fois, qu’il est possible d’isoler des phages actifs susceptibles de lyser des variants S et R de M. abscessus, justifiant amplement la poursuite de ces études.

Ainsi, la troisième année de thèse s’articulera, de façon très logique dans la suite des résultats présentés et selon le calendrier initial, essentiellement autour de deux thèmes centraux : 

1) La caractérisation des nouveaux marqueurs de résistance de plusieurs phages, ce qui nous renseignera sur les facteurs bactériens qui sont nécessaires à l’infection pour ces phages et sur la spécificité de ces mécanismes. Nous essaierons de comprendre, au niveau moléculaire, l’importance de la voie du mycothiol et le rôle potentiel de la protéine MSMEG_4252 dans la susceptibilité de l’infection par le phage thérapeutique BPs. Les résultats issus de ces travaux nous renseigneront sur des composants moléculaires inédits gouvernant les interactions spécifiques entre les phages et leur bactérie cible et nous permettront de savoir s’ils sont spécifiques du phage thérapeutique BPs ou nécessaires à l’infection par d’autres phages.  

2) La méthode récemment mise en place au laboratoire, à partir d’échantillons environnementaux, pour isoler des phages sélectionnés sur M. smegmatis a été validée puisqu’elle nous a permis d’isoler trois nouveaux phages dont les analyses génomiques sont en cours. De manière intéressante, deux de ces phages sont très actifs in vitro pour lyser une souche clinique de M. abscessus. Dans le but d’étendre plus largement le répertoire de phages actifs sur M. abscessus, et sur base des protocoles adaptés sur M. smegmatis, nous allons tenter d’isoler des phages en réalisant une sélection directe sur M. abscessus (souche lisse et rugueuse). Pour cela, nous privilégierons l’isolement de phages à partir d’échantillons issus des eaux usées ou de syphons domestiques et hospitaliers. 

En résumé, la caractérisation de ces phages, au niveau fonctionnel et génomique, permettra d'accroître le panel de phages thérapeutiques destinés à lutter contre certaines formes d’infections à M. abscessus, actuellement réfractaires aux quelques phages disponibles. L’ensemble de ces résultats devrait accélérer la mise en place de futures études cliniques menées sur un plus grand nombre de patients pour apporter la preuve scientifique de l’innocuité et de l’efficacité de la phagothérapie dans le contexte de la mucoviscidose.

Au-delà de ses aspects fondamentaux, les perspectives d’applications médicales issues de ce projet sont bien réelles et les possibilités d’applications en clinique largement envisageables, comme le témoigne plusieurs études récentes qui relatent d’une amélioration générale de l’état de santé des patients avec augmentation des fonctions pulmonaires chez au moins la moitié des patients traités par phagothérapie en complément de l’antibiothérapie. Si ces traitements restent aujourd’hui limités pour un usage à titre compassionnel, ils mettent cependant en avant l’intérêt majeur de la phagothérapie dans le cas d’infections chroniques sévères multi-résistantes aux antibiotiques. Ces études nécessitent toutefois d’être étayées par des travaux expérimentaux plus approfondis en laboratoire. Dans ce contexte, notre projet s’inscrit dans la logique de ces études cliniques afin de fournir davantage d’éléments fondamentaux permettant de mieux appréhender les interactions et spécificités des phages avec leur spectre d’hôte et de pouvoir mieux optimiser les cocktails phagiques à usage thérapeutiques.

Résultats obtenus :
Dans les mois et l’année à venir, nos efforts pour tenter de comprendre le rôle des transporteurs impliqués dans les voies d’assimilation du fer par S. apiospermum vont se poursuivre.

Concernant la voie RIA, nous allons poursuivre la caractérisation phénotypique des mutants générés. Plus précisément, la sensibilité des souches mutantes à différents antifongiques mais également à des molécules générant un stress de la paroi, un stress osmotique, ou encore un stress oxydant sera évaluée. Afin de compléter ces expériences, si les premiers résultats menés en milieu gélosé ont démontré des différences entre la souche parentale et les souches mutantes, les cinétiques de croissance des différentes souches fongiques seront évaluées, et nous vérifierons notamment l’absence d’impact de ces mutations sur la croissance des cellules fongiques en présence d’un large excès de fer, et rechercherons une inhibition de la croissance fongique en milieu carencé en fer.

Dans un second temps, dans la cas où des clones présenteraient une croissance altérée en milieu carencé en fer, ils seront alors soumis à une étude d'interaction hôte-pathogène in vitro en comparant la capacité de nos souches mutantes et de la souche parentale à échapper à la phagocytose par des macrophages, les premières cellules immunitaires impliquées dans l’élimination des spores fongiques. Nous pourrons ainsi évaluer l’adhérence et l’ingestion des spores des différentes souches après ingestion par les macrophages, ainsi que leur taux de survie et l’impact sur la réponse immunitaire par le dosage des principales cytokines impliquées dans la réponse précoce et tardive de l’hôte à l’encontre de S. apiospermum. Enfin, la virulence des souches mutantes de S. apiospermum sera évaluée dans le modèle Galleria mellonella. La réduction de la virulence de nos mutants comparée à la souche parentale pourra être confirmée dans un modèle expérimental de scédosporiose disséminée sur souris immunocompétentes.

D’autre part, nous étudierons l'expression des gènes liés au métabolisme et au maintien de l’homéostasie du fer dans la souche parentale et les souches mutantes générées en amont. Les résultats pourraient fournir des informations précieuses quant à l'interaction entre les deux voies (i.e. voie SIA et voie RIA) dans le cadre de l’assimilation du fer par le champignon S. apiospermum.

Afin d'obtenir une vision globale des voies de régulation de l'assimilation du fer et des voies métaboliques impactées par la carence en fer dans la cellule fongique, le séquençage de l'ARN total sera effectué dans les mêmes souches. Grâce à cette analyse transcriptomique, nous préciserons les voies métaboliques impactées par le blocage de l’internalisation des complexes ferri-sidérophores, en focalisant sur les processus et voies métaboliques déterminants dans la pathogénicité et la virulence, et déterminerons les gènes impliqués dans la régulation de l'assimilation du fer, gènes qui pourraient également constituer de nouvelles cibles antifongiques.

Concernant la voie SIA, suite à la sélection de 4 transporteurs des complexes ferri-sidérophores hypothétiques, nous allons générer les souches mutantes correspondantes. Une fois les mutants validés, nous mènerons des études phénotypiques similaires à celles menées pour les mutants ciblant la voie RIA (i.e. impact des délétions sur la croissance du champignon, études in vitro et in vivo d’interactions hôte-pathogène).

Dans les prochains mois, une analyse phylogénétique robuste sera menée afin de tenter de caractériser formellement les différents transporteurs prédits à partir du génome de S. apiospermum. Pour se faire, les séquences homologues ou validées des transporteurs seront collectées dans les génomes fongiques, et des arbres phylogénétiques seront construits à partir de ces séquences. Au final, cette analyse in silico sera réalisée à l'aide d'un ensemble de données robustes issues de 90 génomes fongiques. Une étude similaire sera menée en parallèle pour les transporteurs de la voie RIA. Nous tenterons ainsi d’élucider la dynamique évolutive qui a conduit à l'émergence et à la distribution phylogénétique des gènes FTRA dans le règne fongique.