Etude fonctionnelle de séquences cis-régulatrices associées à des changements de méthylation de l’ADN dans la mucoviscidose

Porteur du projet : Albertina DE SARIO

PhyMedExp - INSERM 1046 - CNRS 9214 - Université de Montpellier

Contexte :
Parmi les patients atteints de mucoviscidose (CF), certains ont une maladie pulmonaire sévère, d’autres ont une pathologie modérée. Cette variabilité est déterminée à la fois par des facteurs génétiques, notamment le type de mutation que le patient porte dans le gène CFTR, et par des facteurs environnementaux, à savoir le mode de vie (alimentation, prise de médicaments, activité physique, etc). En effet, l’environnement peut modifier le fonctionnement de l’ensemble de nos gènes via la méthylation de l’ADN. Lors de précédentes études, nous avons montré que la méthylation de l’ADN est altérée chez les patients CF. Nous faisons l’hypothèse que les variations de méthylation pourraient altérer certains gènes et par ce biais moduler la sévérité de la mucoviscidose.

Objectifs :
L’objectif globale de ce projet de recherche consiste à expliquer la variabilité clinique qui caractérise les patients atteints de mucoviscidose. L’objectif spécifique consiste à vérifier si les variations de méthylation de l’ADN observées chez la patients ont un impact sur le fonctionnement de certains gènes. Nous avons sélectionné sept séquences d’ADN differentiellement méthylées chez des patients atteints de mucoviscidose comparés à des témoins. A présent, nous essayons de comprendre si ces variations de méthylation modifient l’expression des gènes. D’abord, nous analysons avec des outils informatiques des informations disponibles dans les bases de données publiques et faisons des prédictions sur l’impact de la méthylation de l’ADN sur les gènes. Puis, nous vérifions les prédictions avec des tests fonctionnels qui sont réalisés sur des cellules d’origine sanguine ou bronchiale cultivées in vitro.

Perspectives :
Afin de confirmer davantage que la variation de méthylation de l’ADN d’une région affecte le fonctionnement d’un gène cible, nous envisageons d’utiliser une technologie récente dite de ciseaux moléculaires. Normalement utilisés pour changer la séquence ADN avec une spécificité très élevée, ici les ciseaux moléculaires seront utilisés pour augmenter ou diminuer la méthylation des gènes d’intérêt dans des cellules en culture, afin de mimer les changements observés chez les patients atteints de mucoviscidose. Après avoir induit ces changements de méthylation de l’ADN, nous vérifierons s’ils sont suivis d’un changement de l’expression des gènes associés.

Résultats obtenus :
Grâce aux analyses bioinformatiques, nous avons prédit que des séquences d’ADN differentiellement méthylées chez les patients atteints de mucoviscidose pourraient réguler l’expression de sept gènes associés. Les prédictions bioinformatiques nécessitent la mise en place de tests fonctionnels pour corroborer les conclusions. Nous avons conçu trois types de test. Au cours de ces premiers mois, nous avons réalisé des expériences préliminaires pour optimiser les protocoles d’analyse de l’expression, de la méthylation de l’ADN et de la régulation in vitro. De plus, nous avons avons testé un modèle cellulaire. Nous avons traité des monocytes en culture avec une molécule issue de la paroi bactérienne afin de mimer la réaction inflammatoire présente chez les patients atteints de mucoviscidose. Comme cela était attendu, ce traitement a modifié l’expression (c.a.d. le fonctionnement) des gènes objet de notre étude. Ce modèle nous permet maintenant de vérifier si les changement d’expression sont accompagnés d’un changement de méthylation de l’ADN.