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Rôle de la protéine tyrosine phosphatase « Lyp » (PTPN22) dans l’activation des polynucléaires neutrophiles humains : Une nouvelle cible thérapeutique dans l’inflammation pulmonaire de la mucoviscidose.

Dernière mise à jour 30.09.2021 à 11h34

Axe de recherche : Inflammation Délégation territoriale : Île de France Domaine de recherche : Recherche fondamentale

Porteur du projet : Jamel El Benna

Centre de Recherche sur l'Inflammation - INSERM U-1149, CNRS ERL8252

Contexte : 
Une des caractéristiques de l’atteinte pulmonaire de la mucoviscidose est l’accumulation dans les voies aériennes de cellules inflammatoires appelées polynucléaires neutrophiles. Ces cellules jouent un rôle clé dans la défense de l'organisme contre les agents pathogènes (bactéries, champignons et virus). Pour assurer cette fonction, ces cellules produisent des molécules toxiques (pour les agents pathogènes) mais qui sont susceptibles d’induire des lésions tissulaire lorsqu’elles sont produites en trop grande quantité. Parmi celles-ci, certaines substances oxydantes dites Formes Réactives de l’Oxygène (FRO) dont les radicaux libres font partie, sont produites par un système enzymatique complexe qui est suractivé par des médiateurs qui favorisent l’inflammation et sont présents en quantité importante dans les voies aériennes de patients atteints de mucoviscidose. Une meilleure compréhension des voies d'activation du système producteur des formes toxiques de l’oxygène potentiellement délétères pour le tissu pulmonaire permettrait d'envisager de les inhiber par des agents pharmacologiques dont les cibles seraient bien caractérisées.

Objectifs :
Limiter l’hyper-activation du système générateur des radicaux libres et des autres molécules oxydantes des polynucléaires neutrophiles dans leur environnement inflammatoire tout en préservant une production normale nécessaire aux réponses anti-bactériennes est une nouvelle stratégie anti-inflammatoire. L’objectif de notre projet est de comprendre comment les agents pro-inflammatoires augmentent considérablement la production des molécules oxydantes par les polynucléaires neutrophiles et à favoriser leur effet délétère pour les poumons. Nous proposons en particulier d’étudier le rôle d’une protéines phosphatase appelée Lyp dont le gène a été impliqué dans plusieurs pathologies inflammatoires et de tester ses inhibiteurs sur l’inflammation pulmonaire dans un modèle murin.

Perspectives :
Nous continuerons à approfondir l'étude du rôle de Lyp dans les neutrophiles et en particulier:

-Etude de la localisation de Lyp dans les PN humains: La localisation de Lyp sera étudiée en utilisant des approches complémentaires, notamment le fractionnement subcellulaire et la microscopie confocale. Résultats préliminaires: nous avons préparé différentes fractions de PN (Cytosol, membrane plasmatique, granules spécifiques, et granules azurophiles) par cavitation à l'azote et gradient de percoll. La présence de Lyp dans ces fractions sera prochainement détectée par SDS-PAGE et Western Blot en utilisant un anticorps spécifique. La localisation de Lyp par microscopie confocale est en cours de réalisation. 

-Etude des effets des inhibiteurs de Lyp sur la phosphorylation des protéines de la NADPH oxydase: Les résultats que nous avons obtenus montrent deux inhibiteurs de Lyp inhibent la production de ROS par les neutrophiles stimulés par le fMLP, par le TNFα+fMLF  et par le zymosan opsonisé (Figure 3). Ces résultats suggèrent que Lyp est impliquée dans l’activation de la NADPH oxydase et la production des FRO par les PN. Pour étudier le rôle de Lyp dans la phosphorylation des composants de la NADPH oxydase, grace en parties à la subvention de la VLM, nous avons produit des anticorps anti-phosphoSite de la p47phox, de la p67phox, de la p40phox et de la p22phox qui vont servir à analyser ces phosphorylations. Nous testerons l’effet des inhibiteurs de Lyp sur la phosphorylation des composants de la NADPH oxydase. Résultats préliminaires: nous avons vérifié par SDS-PAGE et Western Blot que les anticorps produits  détectent bien la phosphorylation spécifique de la p47phox, de la p67phox, de la p40phox et de la p22phox.

Etude de l'activation de Lyp dans les PN humains: Pour vérifier si les agents proinflammatoires sont capables d’induire l’activation de Lyp dans les neutrophiles, nous mesurerons son activité par des techniques que nous avons développées dans le laboratoire. Les neutrophiles seront traités ou non par les agents pro-inflammatoires et Lyp sera immunoprecipitée en utilisant un anticorps spécifique et son activité sera mesurée en utilisant le pNPP (para-nitrophenylphosphate) ou des protéines tyrosine phosphorylées (CSK, Lyn…) comme substrats.

-Identification des partenaires de Lyp dans les neutrophiles humains.

-Effet des inhibiteurs de Lyp sur l’inflammation pulmonaire dans un modèle murin: L’instillation du LPS dans les poumons de souris induit une forte inflammation pulmonaire caractérisée par une accumulation des neutrophiles au sein des poumons et une altération des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons collaboré dans le passé avec le Dr Rafik Bachoul (Université de Gabès, Tunisie) qui maitrise ce modèle. En collaboration avec son laboratoire, nous testerons les effets des  inhibiteurs de Lyp sur l’inflammation pulmonaire. Dans ce modèle, le recrutement et l’activation des PN seront analysés. Les inhibiteurs seront injectés par voie intrapéritonéale (IP) aux souris avant l’instillation du LPS par voies aériennes. Après 24h, les souris seront sacrifiées, les poumons seront prélevés, les neutrophiles seront comptés et leur état d’activation analysé, les cytokines pro-inflammatoires seront dosées et une analyse histologique sera réalisée.

Résultats obtenus :
Les résultats obtenus pendant cette première année montrent que la protéine phosphatase Lyp est bien exprimée dans les neutrophiles humains circulants à l’état de repos. La comparaison de cette expression entre différentes cellules montre et confirme que les neutrophiles expriment moins Lyp que les lymphocytes, mais de façon similaires aux monocytes (Figure 1).  

Nous montrons aussi que plusieurs agonistes inflammatoires augmentent l'expression de Lyp dans les PN à des temps courts (moins d'une heure) (Figure 2). De façon surprenante, des particules issues de champignons  (zymosan opsonisé), particules qui activent la phagocytose induisent la plus forte expression de Lyp dans les PN.

Les résultats que nous avons obtenus montrent deux inhibiteurs de Lyp inhibent la production de ROS par les neutrophiles stimulés par le fMLP, par le TNFα+fMLF  et par le zymosan opsonisé (Figure 3). Ces résultats suggèrent que Lyp est impliquée dans l’activation de la NADPH oxydase et la production des FRO par les PN.

Nous avons aussi réussi à produire des anticorps polyclonaux anti phospho-Sites des protéines de la NADPH oxydase pour étudier l'effet de Lyp sur ces phosphorylations.