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Protéines exportées par le système de sécrétion de type VII ESX-4 de Mycobacterium abscessus : quelles cibles pour le développement d'un test diagnostique et d'un vaccin ?

Dernière mise à jour 06.08.2020 à 13h15

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale : Île de France

Porteur du projet : Jean Louis HERRMANN

UFR Des Sciences de la Santé, Université de Versailles Saint Quentin en Yvelines - UMR1173



Contexte :

Nous avons observé́ et publié très récemment, dans la revue de l'Académie des Sciences Américaine, le rôle de plusieurs gènes responsables de la virulence de Mycobacterium abscessus, une bactérie qui infecte fréquemment les poumons de patients souffrant de la Mucoviscidose. Ces gènes contribuent à l'assemblage et l'organisation de ce que l'on appelle un appareil de sécrétion de type VII, c'est-à-dire, un élément fonctionnel important de la mycobactérie qui lui permet d'exporter à sa surface ou de sécréter dans le milieu extérieur des protéines qui peuvent constituer des facteurs de virulence. Nous avons montré́ que la perte de ce système de sécrétion ne permettait plus à M. abscessus de survivre au sein des macrophages humains et par conséquent de ne plus persister dans l'organisme infecté. Nous avons identifié́ plusieurs protéines secrétées que nous proposons d'étudier dans le contexte de ce projet.



Objectifs :

Dans une démarche diagnostique, voire vaccinale, nous allons étudier le système de sécrétion de type VII, que nous avons identifié́ chez M. abscessus et essayer de voir s'il libère dans le milieu extérieur des protéines qui pourraient être utilisées, à l'instar de celles connues chez M. tuberculosis, agent de la tuberculose, en vue de la mise au point d'un test diagnostique et d'un vaccin. Nous essaierons également de comprendre leur rôle dans la physiologie et la virulence de M. abscessus, et si les deux systèmes existants chez ces deux mycobactéries, fonctionnent de manière similaire. Notre objectif principal est d'identifier les éléments sécrétés par ce système afin de développer un test diagnostique et un candidat vaccin pour lutter contre M. abscessus qui est une bactérie persistante, émergente et notamment difficile à éradiquer, étant donné sa multi-résistance aux antibiotiques, vaccin qui pourra limiter la consommation d'antibiotiques vis-à-vis de cette bactérie et chez ces patients sous antibiothérapie intensive.



Perspectives :

La souche vaccinale BCG (non infectieuse) qui est dépourvue du locus esx-1 de M. tuberculosis (mycobactérie responsable de la tuberculose), va être transformée et nous allons y insérer le locus esx-4 de Mabs pour étudier si la virulence de cette souche vaccinale est restaurée. Pour cela, nous infecterons des souris avec cette souche transformée et nous analyserons si elle est capable d’induire des abcès pulmonaires. Si c’est le cas, nous mettrons pleinement en évidence l’importance de ce locus esx-4 dans la pathogénicité de Mabs. En parallèle, une souche de M. tuberculosis, délétée pour le locus esx-4 de M. tuberculosis (qui comprend 5 locus esx, esx-1 à 5, contrairement à Mabs qui ne comprend que 2 locus esx-3 et esx-4) va aussi être transformée par ce même plasmide. Entre le locus esx-4 de M. tuberculosis et de M. abscessus, on observe un gène supplémentaire chez esx-4 de Mabs, le gène codant pour la protéine EccE4. On pense que ce gène a une importance majeure dans ce locus puisque Mabs est très pathogène sans le locus esx-1 de M. tuberculosis qui est le facteur de virulence majeur de cette mycobactérie. Nous analyserons la capacité de cette souche présentant le locus esx-4 de Mabs, à s’échapper du phagosome, il s’agit d’un organite présent dans les cellules humaines qui est responsable de la digestion des microbes et les mycobactéries sont capable de s’en échapper pour persister chez l’homme. Nous disposons au laboratoire des outils pour réaliser cette mesure. L’ensemble de ces expériences seront réalisées à l’Institut Pasteur dans l’équipe du partenaire qui est habilité à travailler sur M. tuberculosis. Notre 2e axe de recherche est basé sur l’étude des produits secrétés par ce système ESX-4 de Mabs afin de mesurer si ces produits secrétés pourraient être utilisés à des fins diagnostique ou vaccinale. Nous avons montré une diminution de la secrétion d’Esx-T pour le mutant dépourvu du gène eccB4 du locus esx-4 de Mabs en comparaison avec la souche sauvage. Nous souhaitons confirmer ce résultat par l’analyse de la secrétion d’Esx-T avec l’ensemble des mutants du locus esx-4 dont nous disposons. Cette approche, nous permettra de déterminer l’importance de chaque composant du système ESX-4 dans la secrétion d’Esx-U et -T. Nous avons mis en place une collaboration avec la plateforme de spectrométrie de masse de l’institut Curie et nous allons analyser si Esx-U et Esx-T ont d’autres partenaires qui pourraient être immunogènes et utilisés pour un test de diagnostique chez les patients atteints. Nous poursuivrons l’étude du devenir du mutant délété pour les gènes esx-U et esx-T (Δesx-UT) afin de comprendre ce qu’ils deviennent lorsque l’on infecte des macrophages avec cette souche. En effet, de façon inexpliquée le mutant croît significativement plus dans ces cellules par rapport à la souche sauvage. La capacité du mutant à s’échapper du phagosome ou sa capacité à inhiber l’acidification de ce dernier (étape essentielle pour la destruction des microbes) seront analysées pour déterminer son comportement dans le phagosome. Ces techniques ont été mises au point pour la mycobactérie intracellulaire M. tuberculosis par le partenaire 1 pour l'échappement au phagosome et ce protocole a été adapté à Mabs (Laencina et al., 2018). Nous testerons aussi la persistance de Mabs de type sauvage en comparaison avec le mutant Δesx-UT suite à des infections de souris. La virulence de ce mutant Δesx-UT et sa capacité à induire des granulomes chez le poisson (zebrafish) sera aussi mesurée (ces granulomes sont observés chez les patients infectés par Mabs). L’ensemble de ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle de ces protéines au cours de l’infection par Mabs. Nous sommes confrontés à une difficulté majeure pour cet axe, qui est l’absence d’activation de réponse immune spécifique vis-à-vis des protéines Esx-U ou Esx-T, suite à une infection de souris par la souche de référence de Mabs. Notre collaboration avec l’équipe de l’EMB.



Résultats obtenus :

Nous avons montré que les 2 facteurs majeurs Esx-U et Esx-T du système de sécrétion ESX-4 de la mycobactérie M. abscessus sont libérés dans le milieu de culture à l’instar de ce qui se passe pour les facteurs Esat-6 et CFP-10 qui sont secrétés par le système de sécrétion ESX-1 chez la mycobactérie responsable de la tuberculose. Ces 2 facteurs (esat-6 et cfp-10) sont utilisés comme test de diagnostic et de plus lorsque l’on enlève le système de sécrétion qui permet leur libération, on obtient la souche vaccinale BCG pour l’homme. Comme pour Esat-6 et CFP-10, les facteurs secrétés de M. abscessus Esx-U et Esx-T interagissent. Nous montrons que lorsqu’ils sont absents de M. abscessus, cela change le taux de multiplication de la bactérie dans les cellules du système immunitaire (ici les macrophages). De plus, l’absence de ces facteurs empêche la bactérie de s’échapper du phagosome qui est l’organe cellulaire responsable de la destruction des bactéries phagocytées montrant que ces facteurs semblent nécessaires à la mycobactérie pour échapper au système immunitaire.