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La mucoviscidose, une "cis-ruption disorder" ?

Dernière mise à jour 09.08.2019 à 11h41

Axe de recherche : Génétique Délégation territoriale : Côtes d'Armor-Finistère

Porteur du projet : Claude FEREC
EFS - INSERM U1078

Contexte : 
Le gène CFTR, responsable de la mucoviscidose, a été identifié en 1989. Une modification, ou mutation, du gène engendre un défaut de la protéine CFTR. Malgré la découverte de plus de 2000 mutations, les mutations de quelques patients atteints de mucoviscidose restent non identifiées. Les relations entre les mutations (le génotype) et l’expression de la maladie (le phénotype) ont été mieux comprises, mais de nombreuses questions sont encore en suspens pour comprendre les mécanismes de régulation de ce gène ainsi que la variabilité clinique de l’expression de la maladie : la mucoviscidose ou une de ses formes atténuées. Grâce au développement de nouvelles techniques, des régions régulatrices à distance du gène CFTR ont été identifiées. Une variation au niveau de la séquence de ces régions régulatrices pourrait impacter l’expression du gène CFTR et expliquer ces cas de mucoviscidose non élucidés, ainsi que la variabilité clinique.

Objectifs :
L’objectif de ce projet est d’une part de mieux caractériser ces régions régulatrices à distance du gène CFTR. Dans ce sens, nous comptons identifier les protéines régulatrices impliquées et nous chercherons à mieux décrire le réel impact fonctionnel sur le gène CFTR et ainsi sur le niveau d’expression de la protéine CFTR.
D’autre part, nous rechercherons si des variations dans ces éléments de régulation, situés en dehors du gène CFTR, pourraient élucider des pathologies du CFTR non expliquées, dans la mucoviscidose et dans une de ses formes frontières, l’Agénésie Bilatérale des Canaux Déférents (ABCD) chez des patients présentant des phénotypes extrêmes (colonisation précoce ou tardive à la bactérie Pseudomonas aeruginosa) ou un génotype incomplet. Et si des altérations de ces éléments régulateurs permettraient d’expliquer la variabilité clinique de l’expression de la maladie, c'est-à-dire des phénotypes très différents chez des patients porteurs de génotypes « CFTR » identiques.

Perspectives :
Actuellement, nous mettons en place les tests d’activité nécessaire pour tester les 5 autres variants potentiellement régulateurs, dans des cellules intestinales et pulmonaires. Ces tests permettront de mettre en évidence le potentiel impact de ces variants sur l’activité du promoteur CFTR et potentiellement un rôle régulateur sur l’organisation 3D du gène CFTR.
Egalement, une collaboration a été mise en place avec l’équipe de Harriet Corvol (Paris), afin de récupérer des ADN de patients atteints de mucoviscidose, porteurs de deux mutations (F508del), la plus fréquente de la mucoviscidose. Les patients présentent une variabilité clinique extrême selon l’âge en capacité respiratoire. Via un séquençage, nous cherchons à identifier un potentiel variant régulateur expliquant cette variabilité clinique. De plus, le séquençage d’un groupe de témoins (167 pères porteurs d'une mutation F508del) va être réalisé.
Un fort effet coopératif est observé entre deux régions régulatrices du gène CFTR. L’insertion d’un premier variant d’intérêt, provoque une forte diminution de l’activité du promoteur CFTR, traduisant une perte de l’effet coopératif entre les régions régulatrices. Le variant est localisé au niveau d’un site de fixation d’un élément régulateur important, EP300. Ce variant pourrait donc affecter le recrutement d’éléments régulateurs, notamment de EP300. Nous allons donc étudier la fixation de EP300 et d’autres éléments régulateurs au niveau de notre région régulatrice d’intérêt du gène CFTR. 

De plus, nous cherchons à mieux comprendre les régions et éléments régulateurs impliqués dans l’organisation 3D du gène CFTR. Grâce à l’enroulement de l’ADN, nous savons que des interactions à distance sont possible et permettent de ramener des régions régulatrices éloignées à proximité du gène d’intérêt pour réguler son expression. Nous mettons actuellement en place des constructions artificielles d’ADN combinant plusieurs régions régulatrices éloignées spécifiques au niveau intestinal qui seront testées en tests d’activité. Plusieurs combinaisons avec ces régions régulatrices ont déjà été testées, montrant un effet coopératif sur l’activité du promoteur CFTR (Ott et al. 2009). Ces combinaisons n’incluaient pas notre région d’intérêt du gène CFTR. Les combinaisons seront testées dans des cellules intestinales pour regarder l’effet de celles-ci sur l’activité du promoteur CFTR, et ainsi affiner la régulation 3D du gène CFTR.
Jusqu’à présent, nous nous sommes intéressés aux potentiels variants régulateurs qui pourraient expliquer des cas d’ABCD avec un génotype incomplet. Nos tests d’activités ont été réalisés avec des cellules intestinales. Il a été montré que les régions régulatrices spécifiques au niveau intestinale et pulmonaire sont également présentes au niveau de l’épididyme (Swahn et Harris 2019). Nous souhaitons prochainement tester nos régions d’intérêts avec des cellules de l’épididyme ou des canaux déférents, car ce sont les cellules touchées dans l’ABCD.
Pour finir, après avoir fini les tests d’activité et l’étude de fixation d’éléments régulateurs, nous reprendrons les études des régions régulatrices par une technique de modification du génome. Cette technique nous permettra d’obtenir des cellules dépourvues d’une région régulatrice ciblée ou bien des cellules porteuses d’un variant régulateur.

Résultats obtenus : 
17 régions régulatrices du gène CFTR ont été analysés chez 112 patients. Dans un groupe homogène de 25 patients atteints d’ABCD porteurs d'une seule mutation très fréquente dans la mucoviscidose, 6 modifications d’ADN (variants) ont une fréquence significativement différente avec la population européenne. En particulier, un des variants est 40 fois plus retrouvé dans ce groupe d’étude que dans la population européenne. Il est situé dans une région potentiellement régulatrice du gène CFTR, et en particulier dans un site de fixation d’une élément régulateur important. Cette région n'a pas d'effet seule, mais en combinaison avec une région régulatrice déjà décrite et spécifique des cellules intestinales, un fort effet coopératif est observé sur l'activité du promoteur CFTR. Ces deux régions régulatrices ont des sites de fixation d’éléments régulateurs communs. Ceci pourrait expliquer l'effet coopératif observé sur l'activité du promoteur CFTR. L’insertion du variant d’intérêt provoque une forte diminution de l’effet coopératif sur l’activité du promoteur CFTR. Ce variant est donc un variant régulateur, diminuant l’activité du promoteur CFTR.