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Validation d'une méthode non invasive de diagnostic prénatal de la mucoviscidose: vers la fin de l'amniocentèse pour les couples à risque de transmettre la mucoviscidose?

Dernière mise à jour 25.07.2017 à 17h05

Axe de recherche : Génétique Délégation territoriale : Île de France

Porteur du projet : Juliette NECTOUX
Hôpital Cochin - Laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire

Contexte :
Le diagnostic prénatal de la mucoviscidose nécessite actuellement une biopsie de villosités choriales ou une amniocentèse, considérées comme des méthodes invasives consommatrices de temps et d’argent, génératrices d’angoisse pour le couple, et associées à un risque de fausse couche ou d’infection maternelle. Pour diminuer ces risques, des méthodes non invasives de diagnostic prénatal (DPNI), basées sur l’étude de l’ADN fœtal circulant (ADNfc) dans le plasma maternel, ont été développées. Cependant, la détection d’anomalies génétiques de l’ADNf est complexe car :
- La quantité d’ADN plasmatique totale est limitée, et varie fortement selon les individus, 
- La proportion d’ADN plasmatique d’origine fœtale est faible (environ 6-15%)
- La moitié du génome fœtal est héritée de la mère, et donc identique à celui-ci.
Tout le challenge analytique consiste donc à détecter la sous-population d’ADNfc avec une très grande sensibilité, en distinguant l’ADNfc de l’ADN maternel environnant.

Objectifs : 
L’objectif de ce projet est de développer une méthode fiable, facile et peu coûteuse afin de déterminer le statut affecté ou non d’un fœtus dont les parents sont porteurs d’une ou plusieurs mutations du gène CFTR, à partir d’un prélèvement de sang maternel, en s’affranchissant ainsi des risques de fausse-couche liés au prélèvement invasif. Nous prévoyons d’utiliser différentes stratégies, basées sur l’utilisation de technologies innovantes :
- stratégie directe par PCR digitale et quantification relative de mutation
- stratégie indirecte par NGS, via le génotypage de polymorphismes SNP encadrant le gène CFTR, et quantification relative d’haplotype.
Les capacités des stratégies à correctement détecter et discriminer les fœtus sains des fœtus atteints, par rapport au résultat du DPN invasif seront comparées.

Perspectives : 
Finalisation desarticles en cours
stratégie directe par PCR digitale et quantification relative de mutation : tester l’ensemble de notre cohorte pour évaluer les performances de l’algorithme en pratique clinique et publier ces résultats dans un autre article

stratégie indirecte par NGS, via le génotypage de polymorphismes SNP encadrant le gène CFTR, et quantification relative d’haplotype à développer (panel de capture à designer et commander)

Comparer les 2 stratégies, « directe spécifique de mutation par ddPCR » versus « indirecte, non spécifique de mutation, par NGS ».

Résultats obtenus : 
Stratégie directe par PCR digitale et quantification relative de mutation : la collaboration fructueuse avec un statisticien de Paris Descartes a permis de mettre au point un algorithme statistique visant à distinguer les deux hypothèses suivantes : H0 : le fœtus est atteint de mucoviscidose (ie : il a hérité des mutations de ses deux parents) et H1 : le fœtus est non atteint de mucoviscidose (ie : il est soit porteur sain soit sain). Cet algorithme a été évalué grâce à des simulations informatiques (40 000  grossesses simulées) et se révèle très performant sur la transmission des mutations ponctuelles, tandis qu’il est un peu moins performant concernant les grands réarrangements (délétions ou duplications, moins fréquentes dans CF).

Stratégie indirecte par NGS, via le génotypage de polymorphismes SNP encadrant le gène CFTR, et quantification relative d’haplotype : cette stratégie a été appliquée avec succès aux maladies liées à l’X (DMD, hémophilie), mais doit être adaptée à CFTR au cours de l’année prochaine.