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Bases moléculaires au développement de molécules antibiotiques permettant d'améliorer la clairance pulmonaire des patients mucoviscidose : analyse structure/fonction des régulateurs d'expression des pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa impliquées dan

Dernière mise à jour 25.07.2017 à 16h24

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale : Île de France

Porteur du projet : Isabelle BROUTIN
Faculté de Pharmacie - Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques, CNRS UMR 8015, Université Paris Descartes

Contexte :
La résistance aux antibiotiques est un mécanisme naturel d’adaptation que la bactérie met en place pour échapper aux effets toxiques des antibiotiques à son égard. Cette résistance se manifeste par le développement de différentes stratégies aboutissant à l’inactivation de ces médicaments. Parmi elles, l’efflux actif des antibiotiques par des petites pompes localisées à la surface de la bactérie prend une place de plus en plus importante en clinique. Pour pallier ce problème de résistance suite à l’expression des pompes d’efflux, il a été jugé utile de définir une nouvelle stratégie de lutte antibactérienne. Celle-ci vise à comprendre les mécanismes moléculaires de régulation de l’expression des pompes dans le but de découvrir les acteurs essentiels et d’en faire de nouvelles cibles thérapeutiques. En empêchant l’expression des pompes d’efflux, nous espérons restaurer l’efficacité des antibiotiques existants.

Objectifs :
Au sein de l’équipe dirigée par le Dr Isabelle Broutin, nous nous intéressons à l’étude des pompes à efflux. Ce système permet l’acheminement vers l’extérieur des antibiotiques ayant traversé une ou deux des membranes bactériennes. La compréhension de leur fonction et leur assemblage permettra de concevoir des petites molécules pouvant les inhiber. Récemment, une autre voie de recherche a été définie au sein de l’équipe et vise l’étude des régulateurs géniques de l’expression de ces pompes d’efflux. Deux principales voies sont actuellement décrites : la voie du régulateur « MexZ » qui réprime l’expression de la pompe d’efflux, et celle des régulateurs appelés « ParR-ParS » qui, au contraire, activent l’expression de la pompe d’efflux. L’étude de ces voies par des approches biochimique et structurale nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires déclenchant l’expression génique des pompes d’efflux et fournira les détails moléculaires qui seront nécessaires au design de nouveaux médicaments antibactériens.

Perspectives :
"Pour la dernière année de la thèse, nous allons finaliser les résultats déjà obtenus en cinq points clés :

1) Améliorer les cristaux de MexZ associée à l’ADN reconnu afin d’observer le détail structural de cette interaction ;

2) Obtenir des données SAXS de MexZ associée à l’ADN (dans le cas où la cristallographie de MexZ n’aboutirait pas) ;

3) Obtenir des données SAXS de ParR associée à l’ADN reconnu ;

4) Améliorer la production et la purification de la protéine ParS ;

5) Etudier la fonction catalytique de ParS sur ParR. En effet, ParS est une enzyme qui va modifier chimiquement ParR en y ajoutant un groupement phosphate. Cette modification de ParR est le signal qui permet ensuite l’activation de l’expression de l’opéron de la pompe d’efflux MexXY-OprM. La reproduction in vitro de ce mécanisme biochimique est fondamental pour comprendre la relation entre les protéines ParR et ParS.

La compréhension de ces différents mécanismes de régulation pourrait permettre d’élaborer des molécules capables d'empêcher ces interactions et donc d’inhiber l’expression de la pompe d’efflux responsable de la résistance aux traitements par les antibiotiques de la famille des aminoglycosides."

Résultats obtenus :
"Dans le cadre de la thèse, les protocoles de production et de purification sont mis en place et optimisés pour quatre protéines différentes : MexZ, ArmZ, ParR et ParS. Toutefois, ArmZ produite sous forme d’agrégats insolubles ne pourra être étudié dans le cadre de la thèse.
Ensuite, pour obtenir une image à haute résolution de la structure des protéines, nous devons trouver les conditions chimiques adéquates pour les cristalliser. Cela nous permettra d’exposer les cristaux aux rayons X et d’obtenir une photographie de la protéine à l’échelle atomique. Cependant, cristalliser les protéines peut demander beaucoup de temps. Jusqu'à présent, nous avons réussi à cristalliser la protéine MexZ associée à la séquence ADN cible. Les cristaux doivent être améliorés.
Par ailleurs, une autre façon d’observer la forme des protéines est le de SAXS ou « diffusion des rayons X aux petits angles ». Le SAXS ne permet pas de voir le détail atomique cependant nous pouvons avoir un aperçu intéressant de la forme globale des protéines sans passer par l’étape difficile de la cristallisation. Des résultats de SAXS ont été obtenus pour la protéine ParR et sont en cours de traitement."