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Le porc européen CF: un modèle unique pour décrypter les altérations de glycosylation des mucines pulmonaires

Dernière mise à jour 21.07.2017 à 12h16

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale :

Porteur du projet : Catherine ROBBE MASSELOT
Université Lille1 - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle

Contexte :
Le mucus tapissant les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose est un mucus différent de celui retrouvé chez les individus sains. Il est plus visqueux, plus épais et surtout il permet à des bactéries telles que Pseudomonas aeruginosa de coloniser les poumons sans être éradiquées par les antibiotiques. Des études précédentes ont permis de caractériser finement les modifications biochimiques de ce mucus. Cependant l’origine de ces modifications n’a toujours pas été déterminée, principalement du fait qu’aucun modèle animal recréant la pathologie respiratoire de la mucoviscidose n’est disponible.

Objectifs :
Très récemment, un nouveau modèle porcin de mucoviscidose a été développé. Ce modèle de porcelets CF nous a permis de démontrer pour la première fois que les modifications du mucus pulmonaire se déroulent « in utero », avant l’apparition d’une inflammation délétère ou d’une infection bactérienne. Nos objectifs sont maintenant de comprendre les mécanismes qui conduisent à ces modifications du mucus. En parallèle, nous évaluerons l’impact de ces changements sur la colonisation par P. aeruginosa et sur la prédisposition des patients atteints de mucoviscidose à contracter des infections bactériennes chroniques.

Perspectives :
"Les travaux qui seront conduits au cours de ce projet viseront à identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la forte augmentation de la sialylation des mucines pulmonaires des porcelets CFTR-/-, par rapport aux porcelets CFTR+/+. 

1. Modèle animal de porcelet CF
Le modèle animal de porcelet CF sera maintenu au cours de cette troisième année par les équipes associées n°1 et 3 afin de poursuivre les prélèvements d’échantillons protéiques, d’ARN, de coupes de tissus fixés en paraffine et de LBA nécessaires à la réalisation du présent projet. Des naissances sont programmées tous les 2 mois en croisant des verrats et truies hétérozygotes CFTR+/-. Les porcelets seront sacrifiés à 12h de vie après avoir été infectés ou non par 2ml d’une suspension (5 x 106 cfu/mL) de la souche luminescente PAKlux de P. aeruginosa. 

2. Caractérisation de la glycosylation des méconiums de porcelets CFTR-/- et CFTR+/+
Le méconium est un mélange de sécrétions gastro-intestinales et pancréatico-biliaires, de mucus, de débris cellulaires, de cellules desquamées et de liquide amniotique. Dans notre modèle de porcelets CFTR-/-, 100% des porcelets présentent un iléus méconial à la naissance. Notre hypothèse est que les mucines et les oligosaccharides retrouvés dans le méconium pourraient présenter les mêmes altérations de sialylation que celles observées au niveau des mucines bronchiques. Des échantillons de méconium provenant de 10 porcelets CFTR+/+, 15 porcelets CFTR-/- et 4 porcelets hétérozygotes +/- ont été inclus dans l’étude. Les mucines ont été purifiées, les oligosaccharides libérés et les analyses par spectrométrie de masse sont en cours. 

3. Caractérisation de la glycosylation et de l’expression des mucines intestinales de porcelets CFTR-/- et CFTR+/+
De même que pour le méconium, nous avons émis l’hypothèse d’une altération de la composition biochimique du mucus intestinal (côlon et iléon) des porcelets CFTR-/- à la naissance, par rapport aux porcelets CFTR+/+. Des prélèvements provenant de côlons et d’iléons de 13 porcelets CFTR+/+ et 18 porcelets CFTR-/- ont été inclus. La purification des mucines est en cours.
Des marquages immunohistochimiques en utilisant des anticorps dirigés contre MUC2, la mucine majoritairement sécrétée dans le mucus intestinal, seront réalisés sur coupes de tissus coliques fixés en paraffine. 

4. Evaluation des variations de O-GlcNAcylation des protéines issues des poumons et trachées de porcelets CFTR+/+ et CFTR-/-
La O-GlcNAcylation correspond au transfert d’un unique monosaccharide, la N-acétyl-glucosamine, sur un résidu de sérine ou de thréonine d’une protéine. C’est une glycosylation dynamique et réversible qui présente de très fortes similitudes avec la phosphorylation. Ces 2 modifications post-traductionnelles peuvent d’ailleurs co-exister sur une même protéine. La O-GlcNAcylation participe à la modulation de multiples fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le trafic et la dégradation protéique, la régulation de la signalisation intracellulaire…Elle exerce une fonction importante dans la réponse cellulaire au stress ; en effet, le taux de O-GlcNAcylation augmente après une exposition des cellules à différents stress (chaleur, sels, UV, hypoxie…). 
Notre hypothèse est que le stress oxydatif des voies respiratoires, lié à l’absence d’expression de la protéine CFTR, serait à l’origine de variations de la O-GlcNAcylation de protéines jouant un rôle-clé dans la composition biochimique du mucus.  
Afin de vérifier cette hypothèse, des lysats protéiques de poumons et trachées de porcelets CFTR+/+ et CFTR-/- seront utilisés dans des expériences de western-blotting et d’analyse protéomique par gels 2D afin de quantifier les variations de O-GlcNAcylation des protéines. Les protéines d’intérêt seront découpées du gel puis identifiées après digestion trypsique et analyse par spectrométrie de masse en tandem. Ces analyses seront réalisées par l’équipe r"

Résultats obtenus :
"Nous avons pu confirmer que certaines modifications (sialylation) du mucus bronchique prédisposent les porcelets CFTR-/- à l’infection par une bactérie pathogène,  Pseudomonas aeruginosa. En effet, nous avons observé une augmentation significative de ces modifications chez des porcelets CFTR-/- âgés de six heures ne présentant aucune inflammation  des voies aériennes. L’infection de porcelets CFTR+/+ par la bactérie P. aeruginosa entraine une surexpression de la sialylation du mucus, sans affecter profondément le mucus des porcelets CFTR-/-, déjà modifié du fait de la mutation. Nous avons démontré que P. aeruginosa adhère exclusivement aux composants du mucus modifié, avec une préférence pour celui des animaux infectés, CF ou non-CF.
L’infection in vivo des porcelets CF par la bactérie pathogène démontre clairement que le système respiratoire permettant l’élimination des bactéries piégées dans le mucus ne fonctionne pas chez les porcelets CF."