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Etude de glycoclusters anti-adhésion en tant qu’adjuvants aux bêta-lactamines contre Pseudomonas aeruginosa au cours de la mucoviscidose

Dernière mise à jour 21.07.2017 à 12h09

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale :

Porteur du projet : Benoit KIPNIS
EA7366 - Faculté de Médecine Pole recherche

Contexte :
Les infections liées à Pseudomonas sont des complications fréquentes au cours de la mucoviscidose. Cette bactérie pathogène est de plus en plus difficile à éliminer en raison de sa résistance croissante aux antibiotiques et de sa capacité à se dissimuler dans l'arbre respiratoire au sein des biofilms qu’elle est capable de constituer. Il y a donc nécessité de développer des approches alternatives entravant le pathogène et/ou renforçant la réponse du corps contre la bactérie et permettant son élimination. L'une des hypothèses explorées est de proposer des molécules permettant d'inhiber l'adhésion de Pseudomonas sur les cellules respiratoires. Les premières molécules évaluées avaient une capacité d'adhésion relativement limitée. Grace aux progrès de la chimie, nous disposons maintenant de nouvelles molécules beaucoup plus efficaces.

Objectifs :
L'objectif principal de de notre travail est de proposer de nouvelles molécules capables d'empêcher l'adhésion de Pseudomonas aux cellules de l’arbre respiratoire mais aussi d'interférer avec le biofilm afin de permettre l'action des antibiotiques lorsque celui-ci est dissimulé dans un biofilm. Notre projet s'organise donc en 3 étapes : i) la fabrication de nouvelles molécules capables d’interférer avec Pseudomonas, ii) le choix des molécules les plus efficaces qui bloquent l'adhésion aux cellules et la formation ou les propriétés du biofilm, et iii) la vérification de l'efficacité thérapeutique des composés chez des souris atteintes d'infection aigu et chronique par Pseudomonas. Au terme de ce travail nous aurons ainsi sélectionné des molécules candidates à un développement pharmaceutique pour le patient.

Perspectives :
Volet 1

Sélection des souches
Afin d’étudier les bactéries qui infectent ou colonisent les personnes souffrant de mucoviscidose, la première étape du projet est de sélectionner 10 souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa provenant de patients atteints de mucoviscidose. Pour répondre au problème de la résistance aux antibiotiques, les souches sélectionnées seront résistantes à l’un ou plusieurs des antibiotiques

Elaboration des glycoclusters étudiés
Les composés étudiés, les « glycoclusters », sont constitués d’un cœur sur lequel sont « branchés » de multiples « bras » plus ou moins longs constitués de dérivés de synthèse de sucres (galactose et fucose). En effet, le galactose et le fucose interfèrent avec l’adhésion de Pseudomonas aeruginosa aux cellules respiratoires de l’hôte en se liant à protéines secrétées par la bactérie, les lectines (Lec A et Lec B). Cette interférence est améliorée en branchant de multiples longs « bras » de dérivés de ces sucres ensemble et de manière flexible sur un noyau.
La synthèse nécessite de multiples étapes de chimie organique puis, une fois les réactions mises au point, la synthèse à grande échelle sera réalisée afin d’obtenir les quantités nécessaires aux expériences. Des composés comportant du galactose, inhibant LecA et du fucose inhibant LecB, seront étudiés.
Par ailleurs, certaines séries de molécules comporteront des marqueurs fluorescents qui permettront de visualiser l’interaction en microscopie.
Dix composés seront étudiés, pour n’en retenir que les 3 meilleurs à l’issue du projet.

Interactions glycoclusters / lectines ciblées
Plus les glycoclusters interagissent avec les lectines ciblées, plus l’efficacité à inhiber l’adhésion de Pseudomonas aux cellules est grande. Le projet passera donc au crible la force de l’interaction entre chaque glycocluster et les lectines, par deux techniques (microcalorimétire de titration et résonnance magnétique de surface).
L’efficacité des glycoclusters étant aussi liée à la flexibilité des branches glycosidiques. Cette flexibilité sera étudiée par cristallographie. 

Interactions glycoclusters-bactéries
Les glycoclusters interagissant avec les lectines de Pseudomonas, les multiples branches intéragissent avec plusieurs bactéries qui « s’agrègent ». L’efficacité des glycoclusters est donc aussi liée à leur capacité d’agrégation des bactéries entre elles qui sera donc étudiée par des techniques de microscopie confocale et éléctronique.
Ces études se feront aussi avec des antibiotiques afin d’étudier si cette association modifie les capacités d’agrégation et/ou augmente les bactéries tuées par les antibiotiques (étude de la viabilité des bactéries dans les agrégats par test LIVE/DEAD® BacLight®)

Volet 2

Inhibition de l’adhésion de Pseudomonas aeruginosa aux cellules respiratoires
Cette évaluation repose sur des tests in-vitro qui consistent à cultiver Pseudomonas aeruginosa sur des cellules respiratoires humaines, puis « laver » pour éliminer les bactéries qui n’adhèrent pas et évaluer la quantité de bactéries restant adhérentes. Afin de mesurer la capacité des glycoclusters à inhiber l’adhésion, ces molécules sont introduites en début de co-culture et on évalue le pourcentage de Pseudomonas restant adhérents avec ou sans glycoclusters.
Ces tests seront réalisés avec : a) différents glycoclusters b) différentes doses c) différentes souches de Pseudomonas d) différentes lignées cellulaires respiratoires : de référence (A549) ou adaptées à l’étude de la mucoviscidose car porteuses de la mutation ΔF508 (CuFi-1/ NuFi-1).

Inhibition/perturbation de la formation du biofilm
Cette évaluation consiste à cultiver les souches de Pseudomonas dans des conditions propices à la constitution d’un biofilm qui est un milieu formé de dérivés de sucres et de protéines produites par les bactéries dans lequel elles se multiplient et adhérent aux surfaces à l’abri des antibiotiques et des défenses immunitaires.
Le biofilm sera étudié par m"

Résultats obtenus :
Nous avons réussi à sélectionner 10 souches de Pseudomonas multirésistantes issues de patients infectés ou colonisés et à les manier dans les conditions de culture et de croissance nécessaires aux expériences du projet. Nous avons démarré la synthèse de glycoclusters par 4 composés ayant un cœur triphényléthylène (TPE) et 8 un cœur pérylènedimide (PDI). L’affinité de ces composés pour leurs cibles lectiniques ont été déterminées. Ces composés, été testés dans des mises au point de manière préliminaire sur leur efficacité à inhiber l’adhésion d’une souche de référence de Pseudomonas aux cellules respiratoires en culture et certains (PDI) sont capables d’inhiber jusqu’à 70% et de diminuer la mort cellulaire en rapport. D’autres composés (TPE) s’avèrent trop peu maniables pour réaliser ces expériences. Nous avons également mis au point les premiers modèles d’infection de souris ayant une infection pulmonaire aigüe par les souches cliniques de Pseudomonas étudiées avant transposition des modèles sur des lignées de souris adaptées à l’étude de la mucoviscidose.