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Transfert de gènes par des vecteurs synthétiques : Construction d'un plasmide CFTR optimisé pour son transport dans le noyau des cellules épithéliales pulmonaires CF.

Dernière mise à jour 17.07.2017 à 17h04

Axe de recherche : Thérapie génique Délégation territoriale : Centre - Val de Loire

Porteur du projet : Patrick MIDOUX
Centre de Biophysique Moléculaire - CNRS UPR4301

Contexte :
La thérapie génique dans le cadre de la mucoviscidose a pour objectif de remplacer le gène CFTR muté par le gène CFTR normal fonctionnel chez les malades atteints par la mucoviscidose, ce qui constitue une des principales approches proposées pour le traitement de cette maladie héréditaire. Cependant, les vecteurs synthétiques utilisés pour le transfert du gène CFTR dans les cellules épithéliales CF ne sont pas encore suffisamment efficaces. Le projet a pour objectif d’améliorer le trafic intracellulaire et la délivrance du gène CFTR dans le noyau des cellules épithéliales pulmonaires en équipant le plasmide ADN codant le CFTR avec des signaux pour améliorer sa migration cytosolique vers l'enveloppe nucléaire et son importation nucléaire.

Objectifs :
Nous proposons d’améliorer le trafic intracellulaire d’un plasmide pour augmenter l’efficacité de transfection des vecteurs synthétiques. L’importation nucléaire sera facilitée avec des séquences nucléotidiques reconnues par un facteur de transcription insérées dans la séquence du plasmide. La migration cytosolique sera facilitée par l’intermédiaire d’un peptide se liant aux microtubules. Nous déterminerons les nombres optimaux de peptide  et de signal d’importation nucléaire nécessaire pour construire un plasmide CFTR optimisé pour son trafic intracellulaire. Les validations seront réalisées avec des cellules épithéliales pulmonaires humaines normales et CFTR F508del.

Perspectives :
Avec des plasmides de plus grandes tailles comme pour celui codant le gène CFTR, il est nécessaire d’optimiser le nombre de peptide à accrocher pour la migration le long des microtubules ainsi que le nombre de séquence d’importation nucléaire. Nous continuons la construction de plasmides de 15 kbp codant à la fois le gène de la luciferase et le gène CFTR et qui possèdent différents nombre de peptide et de séquence d'importation nucléaire pour l'optimisation.

Résultats obtenus : 
Nous avons validée la fixation d’un peptide de 5000 paires de bases sur un plasmide en utilisant un oligonucléotide de type LNA. Les résultats ont montré que la stratégie adoptée pour fixer le peptide sur un plasmide est bonne ainsi que l’efficacité de transfection du plasmide lié au peptide. Les résultats ont montré un effet bénéfique du greffage du peptide par rapport à la transfection du plasmide avec un peptide contrôle pour lequel le niveau de transfection reste égal à celui du plasmide sans peptide.