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La protéine prion cellulaire normale (PrPC) dans la mucoviscidose : Rôle dans le maintien de la barrière jonctionnelle de l’épithélium pulmonaire humain en relation avec la protéine CFTR.

Dernière mise à jour 17.07.2017 à 12h08

Axe de recherche : Fonction CFTR Délégation territoriale : Isère

Porteur du projet : Mohamed BENHAROUGA
Université Grenoble Alpes/CNRS/CEA-Grenoble - DRF-BIG/LCBM-UMR5249

Contexte : 
"Pourquoi une personne saine est-elle protégée contre les infections par des pathogènes opportunistes, tandis que les personnes atteintes de mucoviscidose ou qui présentent un épithélium pulmonaire endommagé sont particulièrement sensibles à ces infections? Pour répondre à cette question, il est essentiel de bien comprendre l'interaction dynamique entre le microenvironnement hôte et ces pathogènes. 
Plusieurs facteurs tissulaires, comme la polarité apicale-basolatérale, les complexes des jonctions cellulaires, les protéines de la matrice extracellulaire, le mucus, la complexité multicellulaire, et d'autres facteurs physico-chimiques peuvent individuellement ou collectivement favoriser l’infection aigue et chronique par ces pathogènes. Notre projet vise à comprendre l’origine de la défaillance de la barrière épithéliale pulmonaire et son rôle dans l’exacerbation de l’infection et de l’inflammation. Nous étudierons particulièrement le rôle de la protéine prion cellulaire (PrPC), nouvellement identifiée comme protéine de cette barrière, dans le contrôle de l’étanchéité épithéliale en concert  avec la protéine CFTR."

Objectifs :
 
"Dans la mucoviscidose, le dysfonctionnement de la barrière épithéliale pulmonaire pourrait faciliter une infiltration paracellulaire de bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa, entrainant une surinfection et une inflammation chronique des voies aériennes.
Cependant, les mécanismes à l’origine de cette baisse d’étanchéité de l’épithélium pulmonaire mucoviscidosique restent encore mal connus. Notamment, le rôle de la protéine CFTR dans la régulation des protéines impliquées dans la barrière jonctionnelle reste peu explorer.
Durant notre investigation des protéines de la barrière épithéliale bronchique susceptibles d’être dérégulées dans la mucoviscidose, nous avons identifié la protéine prion cellulaire normale (PrPC) dont le niveau d’expression était significativement élevé. Ainsi, notre projet vise à caractériser le(s) rôle(s) de la protéine PrPC dans la barrière jonctionnelle au cours de la mucoviscidose, et à déterminer son rôle dans le contrôle des protéines du CJ en relation avec la protéine CFTR sauvage et mutée (F508del)."

Perspectives : 
"Plusieurs travaux restent à réaliser pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion normale dans la mucoviscidose.    
1. Introduire la mutation F508 par la méthode de CRISPER-CAS9 au niveau des cellules  HBE-PrP-/-.
2. Générer les cellules HBE surexprimant la protéine PrPC sous un promoteur d’induction (HBE-PrP+).
3. Etude de l’expression et de la localisation des protéines PrPC et CFTR   
4. Immunofluorescence sur les cellules HBE, HBE-PrP-/-, CFBE, CFBE-wt  cultivées sur filtre en conditions liquide/liquide et air/liquide.     
Immunohistochimie sur les coupes de poumons de souris sauvage, PrP-/-, F508del/F508del et Tga20.
5. Etude de la colocalisation tissulaire du PrPC et du CFTR avec les protéines des jonctions serrées, adhérentes et desmosomes.        
6. Etude de la colocalisation cellulaire du PrPC et du CFTR avec les protéines des jonctions serrées, adhérentes et desmosomes.        
7. Etude de l’expression du CFTR et du PrPC dans les souris  sauvage, PrP-/-, F508del/F508del et Tga20 par PCR-q et par western-blot.     
8. Mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans les cellules HBE, HBE-PrP-/-, CFBE, CFBE-wt.     
9. Mesure de la perméabilité dans les souris sauvage, PrP-/-, F508del/F508del et Tga20. 
10. Evaluation de la capacité respiratoire des souris sauvage, PrP-/-, F508del/F508del et Tga20. 
11. Etude du niveau d’expression du PrPC en fonction de la polarité cellulaire cultivées sur filtre en condition liquide/liquide et air/liquide.     
12. Mesure de la RTE dans les cellules HBE, HBE-PrP-/-, CFBE, CFBE-wt cultivées sur filtre en condition liquide/liquide et air/liquide.     
13. Etude biochimique de l’interaction du CFTR et du PrPC avec les protéines des jonctions serrées, adhérentes et desmosomes par immunoprécipitation/western blot et par PLA.      
14. Mesure de l’invasion bactérienne sur les cellules HBE,  HBE-PrP-/-, CFBE, CFBE-wt et HBE-PrP+
15. Mesure de l’invasion bactérienne sur les souris sauvage, PrP-/-, F508del/F508del et Tga20."

Résultats obtenus : 
"Dans la mucoviscidose, nous avons montré que l’expression de la protéine PrPC est augmentée au niveau transcriptionnel et posttranscriptionnel. Cette augmentation a été observée au niveau cellulaire et tissulaire.
Nous avons aussi montré que l’expression d’autres protéines impliquées dans l’homéostasie du cuivre est aussi augmentée dans la mucoviscidose. 
Nous avons montré qu’il n’existe  pas d’interaction entre les protéines CFTR et PrPC.
Par ailleurs, nous avons généré une lignée HBE-PrP-KO, qui nous permettra d’étudier la relation entre les protéines PrPC et CFTR."