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Inhibition du SST3 de Pseudomonas aeruginosa : définition de cibles potentielles dans l’ATPase PscN pour une nouvelle stratégie anti-infectieuse

Dernière mise à jour 17.07.2017 à 12h14

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale : Isère

Porteur du projet : Eric FAUDRY

Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant - iRTSV - Laboratoire BCI UMR1036 - Equipe Pathogénie Bactérienne et Réponses Cellulaires - ERL5261

Contexte :
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste considérée comme un des principaux agents de maladies nosocomiales et responsable d'infections sévères chez les patients atteints de mucoviscidose. Parmi ces patients, les infections à P. aeruginosa deviennent prépondérantes au cours de l’avancée en âge et sont responsables de la destruction des poumons par l’effet combiné de l’action directe des bactéries et de l’inflammation qu’elle déclenche. Le traitement de ces infections est en temps normal difficile et, de surcroit, l’émergence de souches de P. aeruginosa multi-résistantes aux antibiotiques a été observée au cours de la dernière décennie. Notre équipe étudie le Système de Sécrétion de Type III (SST3) qui est un des mécanismes majeurs de virulence des isolats cliniques de P. aeruginosa, permettant l’injection de toxines bactériennes directement dans les cellules cibles. Nous nous efforçons de comprendre finement son fonctionnement et de déterminer de nouvelles cibles pour des thérapies afin de mettre en place des outils permettant de mettre au point ces antibiotiques capables de désarmer la bactérie.

Objectifs :
Ce projet vise à comprendre le fonctionnement d’un élément clé du Système de Sécrétion de Type III (SST3) de P. aeruginosa : l’enzyme dénommée PscN. Bien qu’elle soit absolument nécessaire pour l’intoxication des cellules cibles par la bactérie, son rôle précis n’est pas connu. Nous pensons qu’elle est impliquée dans le mécanisme de sécrétion, un processus complexe. En effet, la bactérie doit premièrement assembler un appareil de sécrétion dans sa paroi puis sécréter les uns après les autres les composants qui viendront former une aiguille à l’extérieur de la bactérie puis ceux qui perforent la cellule cible et enfin les toxines elles-mêmes. L’objectif est donc de déterminer si l’enzyme PscN reconnait et prépare chacun de ces composants afin qu’ils puissent être sécrétés et assemblés. Pour notre étude, nous disposons d’une grande expérience sur l’étude de ces composants et les résultats préliminaires sur l’enzyme PscN sont encourageants. Nous pourrons donc déterminer au niveau moléculaire comment fonctionne cette enzyme si essentielle pour les infections à P. aeruginosa et utiliser ainsi des outils pertinents pour trouver des molécules la bloquant.

Perspectives :
"Durant les 12 prochains mois, nous poursuivrons notre travail suivant trois grands axes : étude des interactions, caractérisation de PscN et recherche d’inhibiteurs. 
Pour l’étude des interactions de PscN avec ses protéines partenaires, le deuxième test mis au point sur une des protéines sera appliqué aux autres protéines afin de confirmer les résultats obtenus précédemment avec le premier test. De plus, cette approche sera complétée par un troisième type de test permettant de caractériser des aspects cinétique qui ne sont pas accessible par les autres tests. Nous effectuerons des essais de compétitions entre les protéines se liant à PscN pour déterminer si elles se lient sur des zones distinctes de PscN. Par ailleurs, nous voulons étudier deux autres fonctions de PscN : sa capacité de dissocier certains assemblages de protéines et sa capacité de dépliement des protéines sécrétées par le SST3.
Pour la caractérisation de PscN, nous nous emploierons d’abord à déterminer par des méthodes biophysiques et enzymologiques si cette enzyme est composée de plusieurs sous-unités. Par ailleurs, nous souhaitons produire différentes formes de PscN : des formes tronquées en certaines parties et des formes comportant des mutations ponctuelles. L’objectif ici est de déterminer quelles sont les parties de la protéine PscN responsables de ses différentes activités : interaction, dissociation et dépliement de ses partenaires. 
Pour la recherche d’inhibiteurs, nous finaliserons les caractérisations in vitro en étudiant notamment un possible synergisme entre les différentes molécules en les combinant deux à deux. Mais nos efforts se concentreront principalement sur la caractérisation de leurs effets sur les bactéries et sur la virulence de la bactérie. Pour cela, nous testerons l’influence des molécules sur la croissance bactérienne, l’activité du SST3 et la mort des cellules induite par le SST3 de P. aeruginosa. L’objectif est d’identifier les molécules au meilleur potentiel anti-virulent, c’est-à-dire inhibant l’action du SST3 sans inhiber la croissance bactérienne. En parallèle, la toxicité des molécules vis-à-vis des cellules eucaryotes sera aussi évaluée."

Résultats obtenus :
"Grâce au test que nous avions développé, nous avons pu compléter la description de la fonction de l’ATPase PscN en montrant quelles protéines elle était capable de reconnaitre préférentiellement. De plus, nous avons pu mettre au point un deuxième type de test avec lequel nous avons confirmé ces résultats pour une protéine et qui sera employé pour les autres protéines.
Par ailleurs, le gène artificiel que nous avions préparé permet maintenant d’obtenir de plus grande quantités de la protéine PscN et de mieux la purifier, en la faisant produire par une souche de P. aeruginosa modifiée. Nous avons démontré que la protéine ainsi produite et purifiée est bien fonctionnelle. 
Enfin, nous avons entrepris de cribler des banques de molécules dans le but d’identifier des drogues capables d’inhiber la liaison de PscN à ses substrats protéiques et donc la virulence de la bactérie. Quinze molécules ont été retenues et nous avons caractérisé le potentiel des sept molécules les plus actives dans des tests in vitro. Les tests d’inhibition de la virulence de la bactérie envers les cellules de mammifère ont également débuté."