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Etude du nouvel activateur transcriptionnel CmrA sur la résistance aux antibiotiques des souches de Pseudomonas aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose (CF)

Dernière mise à jour 18.12.2017 à 16h23

Axe de recherche : Infection Délégation territoriale : Franche-Comté

Porteur du projet : Catherine LLANES
EA 4266 Agents Pathogènes et Inflammation

Contexte :

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste, vivant dans les milieux humides. Elle colonise les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose (CF), entraînant une détérioration progressive de la fonction respiratoire. Les mécanismes par lesquels cette bactérie persiste dans les poumons peuvent en partie s’expliquer par la surproduction de pompes d’efflux capables de renvoyer les molécules toxiques (dont les antibiotiques) hors de la bactérie. C’est le cas de la pompe MexEF-OprN, dont l’activité confère une résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes, deux familles d’antibiotiques majeures de la lutte anti-Pseudomonas. Les bactéries productrices de cette pompe (NfxC), que l'on pensait jusqu'ici peu pathogènes et rares, ont été identifiées récemment par notre laboratoire chez des patients CF et non-CF. Plus fréquentes qu’initialement estimées, elles sont également plus pathogènes. Comprendre comment ces bactéries contrôlent la production de la pompe d’efflux MexEF-OprN fournira des éléments qui pourront s’avérer utiles pour lutter contre la colonisation broncho-pulmonaire par P. aeruginosa.

Objectifs :

Des travaux préliminaires ont permis de constater que la surproduction de la pompe d’efflux MexEF-OprN chez les souches cliniques pouvait être la conséquence de mutations sur des gènes connus (mexS, mexT), mais également inconnus (dans près de 50% des cas). L’identification récente par notre équipe d’un nouveau régulateur (nommé CmrA) de la pompe MexEF-OprN fournit l’occasion d’étudier son rôle chez ces souches inexpliquées. Ce travail sera effectué sur des souches NfxC isolées chez les patients du CRCM de Besançon surproductrices de la pompe en raison de mutations dans mexS, mexT ou cmrA. Chacune de ces mutations sera corrélée à l’âge des patients, au stade de la maladie, et aux cures d’antibiotiques. Les trois types de souches seront également comparés d’après leur résistance aux antibiotiques (fluoroquinolones et carbapénèmes), leur capacité à produire des facteurs de virulence, mais également à coloniser les poumons dans un modèle d’infection pulmonaire chez la souris. Au final, ce travail fournira pour la première fois, des indications complètes sur les modalités d’apparition des mutants NfxC chez les patients CF.

Perspectives :

Même si les mutants cmrA+ sont rares, nous poursuivons leur recherche dans les souches isolées des poumons des patients CF. Notre lien avec le CHRU de Besançon et le CNR Résistance aux antibiotiques, nous permet de disposer d’un nombre important de souches CF de Pseudomonas aeruginosa. Les mutants isolés seront caractérisés en termes de résistance et de virulence et comparés avec ceux que nous avons obtenus in vitro au laboratoire. Enfin, ils seront corrélés à l’âge des patients, au stade de la maladie et bien sûr aux cures d’antibiotiques.

Après avoir montré que les mutants cmrA+ sont très virulents dans un modèle d’infection pulmonaire aiguë chez la souris, nous envisageons de reprendre ces expérimentations en dénombrant les bactéries afin de mesurer leur capacité d’invasion et dissémination dans l’organisme (sang, foie, poumons) en présence ou non d’antibiotiques.

Nous avons montré que, chez les souches sauvages sensibles, la pompe d’efflux MexEF-OprN pouvait être induite par certaines molécules toxiques telles que les aldéhydes et conduire à de la résistance. Afin de comprendre les conditions dans lesquelles MexEF-OprN peut s’activer, nous devons chercher des inducteurs potentiels dans le poumon CF. Récemment, des chercheurs ont montré la présence d’un aldéhyde issu du métabolisme des acides gras polyinsaturés dans les crachats des patients CF : le malondialdéhyde. Afin de voir si la pompe MexEF-OprN peut s’activer dans les conditions de stress oxydatif propres à celles qui existent dans le poumon CF, nous déterminerons si le malondialdéhyde peut avoir un effet sur la résistance et la virulence de la bactérie. Nous étudierons également si cette molécule est capable d’induire d’autres pompes d’efflux (MexAB-OprM ou MexXY/OprM) et élargir la résistance à d’autres molécules utilisées dans le traitement des infections à P. aeruginosa telles que les ß-lactamines ou les aminosides.

Enfin, afin de comprendre le mode de fonctionnement de CmrA, nous allons poursuivre la mise au point du protocole de production de la protéine en vue de la cristalliser pour une étude structurale. Ceci nous permettra de modéliser les mutations identifiées chez les mutants cmrA+ et de voir leur impact sur la structure de la protéine. Les différentes constructions d'ores et déjà obtenues, permettant de produire la protéine avec un tag histidine, vont être exploitées. Néanmoins, nous allons essayer de cloner le gène cmrA dans de nouvelles constructions afin d'obtenir la protéine avec une autre étiquette (telle que le tag streptavidine) pour nos futures caractérisations d'interaction entre partenaires protéiques. En parallèle, les protéines MexS et MexT seront également clonées et purifiées afin de réaliser des expériences d'interaction in vitro. Cela nous permettra de mettre en évidence les possibles interactions entre ces trois protéines, toutes trois impliquées dans la régulation de l'expression de la pompe à efflux MexEF-OprN.

Au final, ce travail devrait permettre une meilleure compréhension au niveau moléculaire du fonctionnement du régulateur CmrA et surtout l’identification des signaux qu’il perçoit. Ainsi, en élucidant la voir de signalisation de CmrA, nous pourrons proposer des solutions pour moduler les effets de la pompe d’efflux MexEF-OprN et combattre l’antibio-résistance.

Résultats obtenus :

Les premiers résultats montrent que P. aeruginosa mobilise de 2 façons différentes le système d’efflux MexEF-OprN, conduisant à la résistance aux antibiotiques : (1) de façon permanente, par le biais de mutations dans les gènes régulateurs de la pompe (mutants cmrA+) ou (2) de façon transitoire, en réponse à un stress. D’après l’analyse des souches CF, la surproduction permanente de MexEF-OprN, probablement coûteuse énergétiquement, ne semble pas être la voie privilégiée par la bactérie, même si les mutants cmrA+ semblent avoir conservé toute leur virulence chez la souris. Par contre, la mobilisation ponctuelle, en réponse à des molécules inductrices toxiques (comme les aldéhydes), permet à P. aeruginosa de se protéger et de croître, même lorsque l’environnement est défavorable. Cette induction, possible grâce à la protéine régulatrice CmrA, ne touche pas que MexEF-OprN, mais également 2 autres système d’efflux : MexAB-OprM et MexXY/OprM, induisant une résistance supplémentaire aux ß-lactamines et aux aminosides. Il est donc important de poursuivre ces travaux par la recherche de nouvelles molécules inductrices propres au poumon CF.